HIV检测的从0到4
2019-05-16 19:44

HIV检测的从0到4

本文来自微信公众号:悦奔一生(ID:H-SHIELD),作者:悦奔一生医学部,头图来源:东方IC


从发现病毒到发明检测


1983年,Robert Gallo博士首次在免疫系统细胞中培养出一种逆转录病毒,这种病毒命被名为HTLV-III。一年后的1984年英国国务院部长玛格丽特·赫克勒(Margaret Heckler),宣布Robert Gallo博士和他在美国国家癌症研究所已经发现了艾滋病的病因,逆转录病毒HTLV-III。


第一个发现HIV的人Robert Charles Gallo博士


在1985年FDA批准了第一项HIV血检,ELISA酶联法,检测血液中的HIV抗体。美国血库开始对储血和用血进行筛查。HIV抗体检测正式面世。1987年4月,FDA批准了Westernblot血液检测(免疫印迹实验)试剂盒,这是一种更具有特异性的HIV抗体检测方法,也是沿用至今的HIV确诊试验方法。


5年后的1992年,FDA批准了一种HIV快速诊断测试剂盒,HIV快速筛查胶体金试验正式面世,该实验也是目前HIV感染初筛中最常用的试验,市面上试纸大多为胶体金检测。


不久后的1994年,全球首款无创HIV检验方法获批,HIV口腔粘膜渗出液试剂盒,这就是我们现在常说的“唾液”试纸。1996年,FDA批准首套自我检测工具包和病毒载量检测。至此HIV监测可及性已大幅度提高,窗口期也大幅度缩短。


从1代到4代


目前,检测 HIV的方法有 100多种[1]。检测种类虽然繁多,但可分为两大类:抗体检测、病毒检测。病毒检测包括细胞培养 (病毒分离 )、p24 抗原检测和病毒核酸检测 。


从第 1代 HIV抗体检测试剂问世到现在[2],HIV血清学检测试剂已经发展到了第 4代。


HIV抗体(绿色)附着在HIV表面蛋白(红色)上. by NIAID


1985 年 3 月,FDA 批准了第 1 个用于血筛的HIV 抗体筛查试剂[3],是以体外培养的 HIV 裂解抗原包被反应板,由于包被的抗原蛋白浓度、纯度低和结构不稳定,因此灵敏度和特异性都不高,但第 1 代筛查试剂的出现仍然具有划时代的意义,标志着 HIV 血液筛查试剂的诞生和使用。第一代窗口期约为三到六个月,这也是很多教材上关于HIV窗口期三个月的出处。


随后的1990年发展了第2代HIV血液筛查试剂[3],包被的抗原为基因工程重组或人工合成肽,酶标记物为抗人 IgG 抗体,可同时检测 HIV-1 和 HIV-2 型,特异性和灵敏度都有所提高,HIV 检测试剂得到进一步发展。


但是二代试剂也有相应的缺陷:无法检测HIV-1 O组。且对第二代试剂来说,若抗体浓度处于一个较高的水平,可能有假阴性的情况发生。因需要稀释抗体再进行检测,因而会导致抗体稀释后在一定时间浓度小于检测下限,通常窗口期为8~10周左右。


酶联免疫法中的钩状效应


钩状效应是指在双抗体夹心法测抗原的一步法ELISA中,测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后,测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直到不显色,而出现假阴性结果。强阳性标本易误测为弱阳性,甚至出现假阴性结果,致使漏检。


一代二代试剂是间接法试剂,在目前已经被淘汰。


1994年,第三代试剂问世[3],相比第二代检测改为了双抗原夹心法,酶标记物也升级成特异性HIV抗体,同时包被了O型HIV抗原。三代试剂可同时测定IgG、IgM,大幅推进了HIV 血液筛查试剂的发展,将窗口期由10周缩短到3周[8]。双夹心法的应用也避免了假阴性的产生,检测者进行检测时无需稀释样本,保证了敏感性,降低了检测操作难度。


总的来说,三代试剂既保证了检测的特异性,又完善了检测的敏感性,同时实现了窗口期的“大跃进”。


1998年,在第三代检测基础上,第四代HIV血筛试剂诞生。它能同时检测HIV的p24抗原与抗体 [3]。相比前第三代试剂,四代试剂把检出时间又提前了4~5天左右,窗口期缩短了近1周。在艾滋病的早期诊断中,它明显优于三代,仅有2周左右的窗口期。[5]


但是,四代检测中,抗原和抗体同时在反应板上,存在相互干扰的可能。这影响了免疫反应的特异性,使四代检测的假阳率略高于三代检测。


抗体到病毒本体


在过去,大多数对HIV的检测是通过病毒以及机体对病毒的一些反应,从而间接对HIV进行检测。而随着科技革新,直接对病毒本身进行检测的方法,登上了历史的舞台。


1996年,HIV-RNA检测通过FDA审批。截至21世纪初,全世界已有33国开始使用核酸检测筛查血液中的HIV:德国于1997年引进核酸检测,瑞士于2002年在法律中规定,必须使用核酸检测筛查献血者HIV。[6]


从 2010 年开始,中国在部分血站试点开展核酸检测。2015年,要求全国实现血站核酸检测的全覆盖[8]


血站核酸检测,保障血液安全


目前,在HIV感染筛查的指标中,HIV核酸检测最为敏感,优于酶联免疫检测,可有效缩短窗口期。有研究显示,核酸检测可将HIV感染窗口期缩短至2. 93 天[7]。目前得益于HIV-DNA检测技术的出现,窗口期得以进一步的缩短。


常见的RNA 20精度核酸检测,窗口期为1周左右,它距离广泛运用于HIV初筛还有一定距离。这是因为,这种检测出报告较慢,可及性较差,且价格过于昂贵。现在,核酸检测主要用于监测感染者的治疗状况,以便及时发现与处理治疗失败的情况。


核酸检测用于初筛大多是婴幼儿的HIV诊疗方面,因为婴幼儿抗体产生并不是那么稳定,对成年人来说,除可能暴露HIV后处在严重恐艾情绪中的人,一般还是推荐在2~3周后进行抗原抗体联合实验或在4到6周后进行抗体筛查。


从抽血到自检


快速HIV检测,是利用特异性高的抗体抗原反应、免疫层析分析技术,来确定血液中是否含有1型或2型HIV抗体(这些抗体通常是gp41、gp120、gp160包膜蛋白)


HIV结构示意图


在1992年5月27日第一个HIV快检上线后至今,HIV快速自检方案也在快速发展,除第一代检测外,其他检测均有发展出HIV快检方案。


现我国市场上可以获得多种国产及进口的HIV 快速诊断试剂,包括硒标记法、金标记法和凝集法。目前,国内血站为减少血液报废,也在献血前使用快速 HIV检测试剂初筛献血者。


其中快速胶体硒法 30 min 内即可报告结果,与 ELISA 法相比在阳性结果方面无统计学差异,与 WB 确证试验比较,有更高的敏感性和准确性,但特异性较WB低(较高的假阳性可能)[8]


快速检测不仅相对便宜,而且检测效能显著。快速检测不但可以使用血清、血浆,全血,唾液,甚至尿液筛查不同病原体,而且还具有操作简便,试剂反应时间短,结果可以目测,不需要特殊的仪器设备,对技术人员要求不高,试剂可以在室温条件下保存等优点,使得检测更为便利。


参考文献


[1]Weber B, Berger A, Rabenau H, etal .Evaluation of a new combined antigen and antibody human immunodeficiency virusscreening assay, VIDAS HIV DUO Ultra[ J] .J Clin Microbiol, 2002, 40(4):1420-1426.

[2]沈霞.艾滋病的实验室诊断 [ J] .中华检验医学杂志, 2003, 26(5):327-328.

[3] 强来英,HIV 抗体诊断试剂的发展.中国健康教育,2006,22( 11) : 863-865.

[4] 李桓,王静,付晓,等. HIV 抗体快速检测的临床意义探讨.儿科药学杂志,2013,19( 8) : 3-5.

[5] 王梓,张立红. 第四代与第三代 HIV 诊断试剂检测结果比较.中国误诊学杂志,2011,11( 3) : 577.

[6] Gottschalk J.,AchermannY,Niederhauser C. First case of HIV window doNATion inSwitzerland after 8 years of universal HIV NAT screening. Abstracts of Swiss transfusion 2010,Joint Congress of WAA,ESFH,BTS/ SRC,SATM / Transfusion and Apheresis Science,2010,43( 10) : S1-S27.

[7] Weusten J,Vermeulen M,van DrimmelenH,et al. Refinement of a viral transmission risk modelfor blood donations in seroconversion window phase screened by nucleic acidtesting in different pool sizes and repeat test algorithms. Transfusion,2011,51( 1) : 203- 215.

[8] Li L,Li KY,Yan K,et al. The history and challenges of blood donorscreening in China. Transfusion Medicine Reviews,2017,31 (2) :89-93.


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